在马云飞和高寒即将步入婚姻殿堂的关键时刻，不期而至的老于带来了"五号特工组"的一项特殊使命——追寻偷盗美国核武器资料的间谍吉川猛夫。为了国家安全，高寒放下新娘的身份，与欧阳剑平、李智博等人一同前往云南，而马云飞和何坚也被迫重新出山。五人组成的团队再次集结，包括语言专家欧阳、工程师爆破专家李智博、特工马云飞、密码专家高寒以及神偷何坚，他们将与日本杀手酒井朝香（酒井美惠子的妹妹）和敌方特务展开一系列紧张激烈的斗争。
初始行动中，五号特工组遭遇陷害，身陷囹圄。在躲避追捕、营救基地负责人和追击吉川的同时，他们还要对抗酒井和松本忠雄。马云飞在基地负责人的见证下揭露了内部叛徒，成功找到失窃资料。日军在中国战场上使用细菌武器，老于请五号特工组出击夏家梁的细菌基地，目标是桥本多于震。在高寒的坚持下，五号特工组决定参与行动，经历艰难险阻，他们炸毁了基地，解救了大批民众。
在平汉铁路和东南亚局势紧张之际，五号特工组追踪着消失的钨金，与日特和军统展开了一场争夺。在重庆的行动中，他们成功获取了蒋夫人手中的虎符，但过程中险象环生。最终在海州会馆，他们找到了钨金并挫败了酒井的计划，而齐南征在救人的过程中牺牲。带着虎符回归，他们揭露了罗特的真实身份，保护了陈纳德，也赢得了美国飞虎队队长的敬重。
在保护陈纳德的行动中，五号特工组面临了更大的挑战。在误会和冲突中，他们发现真正的敌人是冒牌的安全顾问罗特。在孙立人将军的邀请下，他们携带着重要的河道图前往缅甸，却未料到同行的崔媛媛是易容的酒井。在危机时刻，欧阳剑平和陈纳德的救援赶来，五号特工组与酒井朝香的斗争再次升级，但恋人高寒和马云飞的关系却因误会而疏远。
谍战大戏《五号特工组2》是《五号特工组》的姊妹篇，此次由原班人马再次全情出演。
